In het jaar 340 werd Ambrosius te Trier uit Romeinse ouders geboren. Een legende vertelt dat er eens een bijenzwerm boven de wieg van Ambrosius zweefde. De bijen vlogen in zijn mondje en er druppelde honing naar binnen. Vandaar dat de latere beschermheilige van de imkers als bisschop zo honingzoet kon preken.
Na het overlijden van zijn vader, verhuisde het gezin naar Rome, waar Ambrosius zich voorbereidde op een ambtelijke loopbaan te Sirmium. De jonge Ambrosius ambieerde allesbehalve het bisschopsambt. Hij studeerde rechten en retorica, omdat hij politicus wilde worden. Zijn eerste publieke functie bekleedde hij in Sirmium, een stad gelegen in het huidige Slovenië. In 370 werd hij prefect van de twee provincies Liguria en Aemilia met als standplaats Milaan. In 373 werd hij door keizer Valentianus tot stadhouder van Noord-Italië benoemd. In zijn standplaats Milaan werd hij al spoedig een gerespecteerd en geliefd bestuurder.
Na de dood van de bisschop van Milaan trachtte Ambrosius de vrede te herstellen in het door theologische twisten verscheurde bisdom. Orthodoxe katholieken en Christus’ goddelijkheid loochende arianen streden om de lege bisschopszetel. Toen Ambrosius in 374 als neutrale waarnemer aanwezig was bij de turbulente bisschopsverkiezing in de kathedraal, viel plots de keus op hem. Iemand had geopperd: "Ambrosius als bisschop!" Prompt scandeerden de gelovigen dezelfde leus en werd Ambrosius bij acclamatie tot bisschop gekozen. Opmerkelijk, want Ambrosius was nog niet gedoopt; hij was slechts geloofsleerling.
Ambrosius ontving het doopsel en werd op 7 december tot bisschop gewijd. Na zijn wijding begon Ambrosius aan zijn theologiestudie. Al spoedig ontpopte hij zich tot een kundig priester, met een voorliefde voor de armen. Zijn populariteit was zo groot dat een menigte zich verdrong rond zijn werkvertrek, alleen maar om hem te zien lezen en bidden. Zo ook ene Augustinus uit Carthago, de latere bisschop van Hippo. Die was zo onder de indruk van Ambrosius, dat hij zich bekeerde tot het christendom en zich door hem liet dopen.
Ambrosius stelde het gezag van de Kerk boven de autoriteit van de keizer. Hij beval keizer Theodosius I in het openbaar boete te doen, nadat deze bij een opstand in Thessalonika zevenduizend personen in het circus ter dood had laten brengen. De bisschop ontzegde de machtige keizer zelfs de toegang tot de kathedraal. Later wist Ambrosius de keizer ertoe te bewegen alle heidense culten te verbieden. In 391 zou Theodosius het christendom zelfs tot staatsgodsdienst verheffen.
Sint Ambrosius stierf op paaszaterdag 4 april 397. Hij is de geschiedenis ingegaan als een onverschrokken herder en verkondiger van het Woord. Door zijn preken en catechetische geschriften verdiepte hij het katholieke geloof en droeg hij bij tot de verrijking van de theologische traditie. Ambrosius heeft steeds geijverd voor de zuiverheid van het geloof, voor de goede zeden, voor het kloosterleven en voor de eredienst. Hij dichtte Latijnse hymnen en voerde de beurtzang in. Tot de meest bekende behoort wel het 'Te Deum'.
Sinds 1298 wordt hij samen met Augustinus, Hiëronymus en Gregorius de Grote vereerd als kerkvader van het Westen. Zijn relieken rusten in de Basilica di Sant’Ambrogio in Milaan.
De heilige Ambrosius is patroon van imkers, bijen en huisdieren.